Biotecnología. PCR (soluciones)
1.- Defina biotecnología.
La biotecnología, en un sentido amplio, se puede definir como la aplicación de organismos, componentes o sistemas biológicos para la obtención de un bien o servicio. En esta definición entra desde la utilización de canarios en las minas del carbón para la detección de gases nocivos a las modernas técnicas de ingeniería genética y transgénesis o terapia génica.
2.- Cite ejemplos de aplicaciones de la biotecnología a la industria alimentaria, indicando el microorganismo.
En los siguientes procesos de fabricación:
• Pan, vino, sidra, cerveza (levaduras, Saccharomyces).
• Yogur (bacterias, Lactobacillus).
• Vinagre (bacterias, Acetobacter).
3.- ¿Cuál es actualmente el principal método de transformación de material hereditario en plantas?
El principal método de transformación de plantas es la utilización de Agrobacterium tumefaciens, una bacteria que si es portadora de los genes adecuados, transfiere una porción de su genoma a un célula vegetal herida, si bien, en realidad transfiere una porción de un plásmido.
El segundo método de transformación más utilizado en plantas es la biolística (biobalística).
4.- ¿Cuáles son las principales críticas que se han formulado sobre la utilización de alimentos transgénicos?
• Que acabarán con la diversidad de las especies.
• Que pueden ocasionar alergias.
5.- ¿En genética, qué diferencia existe entre un organismo “transgénico” y uno “quimérico”?
• Transgénico es todo organismo que contiene en su genoma ADN de otro organismo.
• Quimera es un organismo que contiene dos genomas diferentes en su cuerpo (soma).
6.- ¿En genética, qué diferencia existe entre un organismo “transgénico” y uno “cisgénico”?
• Transgénico es todo organismo que contiene en su genoma ADN de otro organismo.
• Cisgénico es un organismo que contiene en su genoma fragmentos de ADN de su misma especie pero que ha sido obtenido mediante ingeniería genética. Por ejemplo un individuo tratado mediante terapia génica sería formalmente “cisgénico”.
7.- ¿Con qué dificultades han tropezado los científicos para utilizar microorganismos en la lucha contra las mareas negras?¿Cómo ha contribuido la biotecnología a resolver este problema?
Se conocen microorganismos que degradan hidrocarburos, pero el problema para la descontaminación de mareas negras (formadas por mezclas de hidrocarburos) es que cada especie de microorganismo degrada un determinado hidrocarburo. Mediante técnicas de biotecnología se pretende conseguir un microorganismo que posea las enzimas necesarias para degradar varios tipos de hidrocarburos.
8.- Indique aplicaciones biotecnológicas en las que intervengan células humanas.
• Fecundación in vitro.
• Cultivos celulares para obtener piel artificial (útil para curar procesos ulcerosos y quemaduras).
• Cultivo de células madres embrionarias y lograr que se transformen en diversos tejidos.
9.- Indique una aplicación biotecnológica en la que intervengan virus.
Terapia génica, consistente en recurrir a virus modificados (retrovirus) que son empleados como vectores de los genes.
Clonación en bacteriófagos, o virus que infectan bacterias, normalmente Escherichia coli.
10.- ¿Qué tipos de técnicas de terapia génica existen? ¿Qué enfermedades hereditarias son tratadas principalmente con técnicas de terapia génica?
En la denominada terapia génica lo que se pretende es “curar” o sustituir un gen mutado. Si esa cura se consigue proporcionando una copia adicional, por supuesto no mutada del gen, se denomina “adición génica”. Otra posibilidad de terapia es la “modificación génica” en la que se persigue conseguir mutar de nuevo el gen hacia un alelo normal. Y por último encontramos la “cirugía génica” en la que mediante recombinación homóloga hay que conseguir sustituir la copia mutante por una copia normal del gen.
En la actualidad las enfermedades hereditarias tratadas con éxito mediante terapia génica son las enfermedades de tejido “accesibles”, como las enfermedades de sistema inmunitario. Otras enfermedades en las que es necesario acceder al núcleo de las células de órganos muy concretos como el hígado son actualmente de difícil acceso por la falta de vectores adecuados.
11.- ¿En qué consiste la clonación génica? Indique los pasos o etapas del procedimiento a seguir.
• La clonación génica es la producción de un número ilimitado de copias de un fragmento de ADN.
• El primer paso consiste en la obtención de un número suficiente de copias del fragmento a clonar, y el segundo, en la ligación de ese fragmento a un vector de clonación que será el encargados de producir el número deseado de copias mediante su multiplicación en el agente hospedador adecuado (bacterias para plásmidos, bacteriófagos y cromosomas artificiales de bacterias y levaduras para cromosomas artificiales de levaduras).
12.- ¿Qué es un vector de clonación? Indique un ejemplo.
En la clonación lo que se persigue es la síntesis de múltiples copias idénticas (clones) de un fragmento de ácido nucleico, normalmente de un ADN. Los vectores de clonación son moléculas de ácido nucleico con la capacidad de replicar en un hospedador en las que se introduce un fragmentos de ADN (al que denominamos genéricamente “inserto”) con el fin de que lo multipliquen.
Los vectores de clonación más comunes son los plásmidos (hospedados en bacterias), si bien se han utilizado desde bacteriófagos (por tanto multiplicados o crecidos en bacterias) hasta cromosomas artificiales de levaduras o cromosomas artificiales de bacterias
13.- Aclare el significado de “cromosoma artificial”.
Los cromosomas artificiales son vectores de clonación en los que es posible multiplicar grandes fragmentos de ADN. En el caso de cromosomas artificiales de levaduras (YACs) el vector debe contener (desde un extremo al otro): un telómero, un marcador selectivo, un centrómero, un origen de replicación, un lugar para clonar el ADN (lugar con varias dianas de enzimas de restricción) y otro telómero. En el caso de vectores artificiales de levaduras (BACs), el vector debe contener un origen de replicación de Escherichia coli, un origen de replicación bacteriano y un marcador selectivo.
14.- Defina lo que es un “origen de replicación”.
El origen de replicación es el lugar del cromosoma donde, como su propio nombre indica, se inicia (se origina) la replicación del ADN. Los cromosomas bacterianos (y los plásmidos) suelen tener un solo origen de replicación, mientras que los cromosomas eucariotas tiene varios orígenes por cromosoma.
15.- ¿Qué es una sonda de ADN? ¿En quése basa para localizar segmentos de ADN?
• Una sonda es un fragmento de ADN marcado de alguna forma (por ejemplo, radiactivo o fluorescente). Su especificidad vendrá dada por la complementariedad de las bases (A=T; G=C; A=U, en el caso del ARN, pues carece de T).
• Pueden utilizarse sondas de ADN y ARN. Las de ARN pueden ser de polaridad sentido (o mensajero) o antisentido (antimensajero)
16.- Aclare la utilidad de un gen marcador o “chivato” en un proceso biotecnológico.
Los genes marcadores o chivatos codifican para una proteína que confiere una nueva característica a las células transgénicas, de forma que permite seleccionar aquellas células en las que se ha producido el proceso que se persigue, normalmente la transformación genética de una célula.
17.- Aclare la utilidad de una construcción del tipo antimensajero en un proceso biotecnológico.
Los antimensajeros son moléculas de ARN de la cadena complementaria de un ARN mensajero. Cuando en una célula se reconocen ARN mensajero y antimensajeros se dispara un mecanismo de defensa conocido como PTGS (Silenciamiento Génico Post-Transcripcional) que degrada a las moléculas de ARN mensajero y antimensajeros, lo que a su vez impide que los ARN mensajeros se traduzcan en proteínas.
18.- Cite algunas aplicaciones biotecnológicas en vegetales.
• El golden rice (arroz con vitamina A)
• Las plantas que producen fármacos.
• Las plantas que detoxifican suelos contaminados con mercurio, explosivos y otros contaminantes.
19.- Indique cómo se obtiene y qué es el golden rice.
Mediante la introducción en el genoma del arroz de dos genes de plantas que sintetizan las enzimas de que carece el grano de arroz para sintetizar vitamina A, cuya acumulación ocasiona el color dorado de los granos de arroz una vez descascarillados. El arroz dorado tiene gran importancia en la alimentación de ciertas poblaciones del tercer mundo, sobre todo asiáticas, pues previene la ceguera y otras complicaciones propias de la avitaminosis A.
20.- ¿Podríamos introducir el gen de la insulina humana en una variedad de tomate? Sugiera el posible mecanismo.
Sí. Teóricamente bastaría con conocer la secuencia del gen en cuestión (la secuencia de la insulina en este caso), colocarle un promotor adecuado y se podría expresar el gen en tomate u otras plantas. Un problema a esta estrategia es que la insulina se sintetiza como un precursor, preproinsulina, que una vez sintetizado requiere un procesado postraduccional para producir la proinsulina, que a su vez es procesada para producir la insulina madura y funcional. Todas estas modificaciones puede que no se produzcan en las células de tomate.
21.- Kary Mullis (Premio Nobel en 1993) desarrolló la técnica de la PCR (Polymerase Chain Reaction), ¿podría indicar todo lo necesario para realizar una PCR?
• Una cadena de ADN que se utilice de molde. Puede ser ADN de cadena doble o ADN de cadena sencilla (por ejemplo procedente de la transcripción inversa de una molécula de ARN, lo que se denomina cDNA).
• Iniciadores o cebadores, es decir, moléculas cortas de ADN de cadena simple que son complementarias a cada uno de los extremos 3’ de la parte que se pretende copiar. Estas cadenas sintéticas de 15-20 nucleótidos se utilizan como cebadores, posibilitando la acción de la polimerasa.
• ADN polimerasa termoestable, o sea, que resista temperaturas cercanas a 100 oC sin desnaturalizarse; por ejemplo, la Taq polimerasa, obtenida de la arqueobacteria Thermus aquaticus, que vive en aguas termales.
• Suficiente cantidad de los 4 desoxirribonucleótidos (en forma de trifosfato: dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Un tampón adecuado a pH fisiológico y que incluya Mg2+, cofactor necesario de las ADN polimerasas.
• Termociclador, aparato que automatiza todo el proceso.
Nota.- Imágenes de termocicladores (Internet):
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22.- Describa las fases propias de la técnica PCR.
Una vez introducido en el termociclador (debidamente programado) el tubo con la muestra que se va a amplificar y todo lo necesario para que se realice la reacción, se consideran 3 fases o etapas por ciclo:
• Desnaturalización. Se requiere una temperatura elevada de 94-95 oC para separar las cadenas del ADN que se quiere amplificar. La duración de un ciclo inicial (cuando hay que desnaturalizar ADN genómico compuesto por grandes fragmentos de ADN) suele ser de minutos y la del resto de ciclos de pocos segundos hasta minutos dependiendo del tamaño del fragmento amplificado.
• Hibridación o anillamiento. La temperatura desciende por debajo de la temperatura de desnaturalización de los cebadores hasta 50-60 oC, para hacer posible el emparejamiento de las bases nitrogenadas (A=T, G=C) entre los iniciadores y las cadenas de ADN previamente separadas en la fase anterior. La duración de este paso suele ser de pocos segundos.
• Elongación o extensión. La temperatura sube a 68-72 oC, dependiendo de a polimerasa termoestable utilizada en la reacción, facilitando la copia del ADN inicial o molde. En esta fase es cuando tiene lugar la síntesis in vitro de ADN. Duración, dependiendo del fragmento a amplificar desde pocos segundos a varios minutos.
23.- ¿A qué se llama “tiempo de rampa”?
Al tiempo que tarda el termociclador en cambiar de temperatura para alcanzar la propia de cada fase dentro de cada ciclo, que un programa estándar es: de 95 a 60 oC, de 60 a 72 oC, de 72 a 95 oC, etc.
Cada ciclo, incluyendo la duración de cada fase y los tiempos de rampa, supone entre alrededor de un minuto a varios minutos, según las características del termociclador y la programación introducida. Tras unos 20-40 ciclos se dispone de suficiente ADN para análisis posteriores.
24.- Elabore un diagrama tiempo-temperatura para un ciclo de PCR.
25.- Partiendo de un solo fragmento de ADN, ¿cuántos habrá tras 3 ciclos de PCR? ¿Y después de 15 ciclos?
• La amplificación del ADN mediante ciclos de PCR tiene carácter exponencial: 2n (siendo n el número de ciclos). Por lo tanto:
• En el primer caso: 23 = 8.
• En el segundo: 215.
26.- ¿Qué aplicaciones tiene la PCR?
• Todas las utilidades de la PCR están basadas en la amplificación exponencial de cualquier fragmento de ADN. Los fragmentos a amplificar pueden ser de secuencia conocida o desconocida.
• La amplificación de microsatélites utilizadas en la identificación genética o huella genética es una de las aplicaciones que tiene la PCR, constituyendo una prueba muy importante en medicina forense.
• La detección de organismos genéticamente modificados es otra aplicación de la PCR.
• La PCR también se ha utilizado para realizar las reacciones de amplificación que son necesarias para secuenciar el genoma humano y de otros organismos.