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2.3. Principales técnicas empleadas en biotecnología.

Son  varias  las técnicas  que se emplean hoy día, en biotecnología, siendo las  más utilizadas y que están rindiendo muy buenos resultados las siguientes:

a) ADN recombinante: proceso que permite el aislamiento del gen buscado, el conocimiento de la secuencia de bases que lo conforma y de su estructura y, por último, la introducción del mismo en la célula de destino. Para llevarlo a cabo son de gran utilidad las enzimas de restricción, que permiten la escisión del ADN en puntos concretos, y las ligasas, que realizan lo contrario, es decir, la unión de fragmentos de ADN. Partiendo del material genético de la estirpe de interés se trata de obtener plásmidos recombinantes que porten el gen deseado. Estos plásmidos serán introducidos en las que hemos denominado células productoras, procediendo a insertar el gen en el ADN de éstas.

Es muy normal que en lugar de introducir únicamente el gen aislado resulte más interesante incorporar alguno más. Se habla entonces de trabajo con híbridos, ya que los productos obtenidos serán una mezcla de varias sustancias. Pongamos un ejemplo: a una bacteria, que será utilizada como célula productora, se le incorpora un plásmido que porta tanto el gen que codifica la sustancia deseada como un gen que confiera resistencia frente a determinado antibiótico; esto último permitirá establecer un sencillo protocolo de selección de las bacterias que hayan efectivamente asimilado el plásmido, pues serán las que sobrevivan en un medio de cultivo que contenga dicho antibiótico.

Tecnología del ADN recombinante

b) En 1985, Kary Mullis desarrolló la técnica llamada reacción en cadena de la polimerasa, conocida también como PCR (del inglés polymerase chain reaction), que, a partir de la capacidad de la ADN polimerasa para replicar el ADN, permite obtener en el laboratorio múltiples copias de un fragmento determinado de ADN.

         La reacción en cadena de la polimerasa se lleva a cabo de la siguiente forma.  La molécula o fragmento de ADN que se desea replicar se desnaturaliza para separar las dos hebras de la doble hélice. Para ello se somete el ADN a temperaturas elevadas. Cada una de las dos hebras sirve como molde para sintetizar otra cadena complementaria. A fin de que la ADN polimerasa pueda actuar copiando cada una de las cadenas complementarias, son necesarios unos cebadores adecuados. En la mezcla de reacción debe existir, así mismo, una concentración suficiente de nucleótidos trifosfato, que componen las “piezas de construcción” de las cadenas que se van a sintetizar.

El proceso que se acaba de describir constituye un ciclo de síntesis. Si se repitiera el proceso íntegramente, se partiría de cuatro hebras molde y se obtendrían cuatro moléculas bicatenarias. Si se realizara un nuevo ciclo, se partiría de ocho hebras molde que, a su vez, darían ocho moléculas bicatenarias. En el siguiente ciclo, los moldes serían 16. Se trata, por tanto, de un proceso exponencial, en el que se llevan a cabo tantos ciclos como sea necesario para obtener el número de copias deseado. Tras 10 ciclos de síntesis se puede obtener del orden de un millón de copias de una molécula de ADN.

Reacción en cadena de la polimerasa

   Las aplicaciones de esta técnica son prácticamente ilimitadas y entre ellas se pueden destacar las siguientes:

- clonación de genes.

- estudios evolutivos.

- huellas dactilares del ADN.

- medicina forense.

- pruebas de paternidad.

- etc.

c) La ingeniería genética es también responsable de la introducción del gen, o genes, en la célula productora. Diversos son los métodos que se pueden utilizar, dependiendo del tamaño del material a incorporar y de las células objeto de la incorporación. Se habla de transfección cuando se trata de introducir genes en el interior de bacterias utilizando fagos como vectores. Otros métodos están basados en meras técnicas fisicoquímicas, son la transformación y la transducción, referidos a introducción de genes en bacterias y células eucariontes, respectivamente. En estos casos, se procede simplemente a permeabilizar la membrana, mediante el uso de determinadas sustancias, de las células receptoras, tras lo que hay que añadir al medio la solución con el gen. Otra posibilidad implica la utilización de los denominados "cañones", técnica que consiste en adosar el gen a micropartículas de oro que son disparadas sobre las células productoras, normalmente en cultivo. Los tres conceptos mencionados no son, de todas formas, acepciones estrictas y se utilizan indistintamente con relativa frecuencia.

Si la inoculación del material genético extraño se realiza en las células reproductoras de animales o plantas, se denomina  transgénesis; de modo que todas las células del organismo de nueva formación tendrán alterado su patrimonio genético, llamándose a estos organismos transgénicos.

Transfección

1. Inclusión del ADN vírico con el gen que se desea clonar en la cabeza del fago. 

2. Autoensambaje de la cola y otras proteínas víricas. 

3. Inyección de un vector de clonación en una célula bacteriana.

 

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